| 摘 要： | 目的检测Notch受体和配体在甲型H1N1流感患者中的表达,观察Notch信号通路对甲型H1N1流感病毒特异性CD8~+T细胞的调控作用。方法本研究入组轻症甲型H1N1流感患者27例、重症甲型H1N1流感患者11例和健康对照者18例。实时定量PCR法检测外周血单个核细胞(PBMC)中Notch受体和配体mRNA的相对表达量。PBMC与Notch信号通路抑制剂DAPT刺激培养24 h后,流式细胞术检测病毒特异性CD8~+T细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的变化,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测病毒特异性CD8~+T细胞分泌穿孔素和颗粒酶B的变化。纯化HLA-A2限制性患者CD8~+T细胞,DAPT刺激培养24 h后建立与甲型H1N1病毒株感染的NCI-H345细胞的直接接触和间接接触培养系统,通过检测乳酸脱氢酶的释放计算CD8~+T细胞诱导靶细胞死亡比例,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清TNF-α和IFN-γ水平,评估CD8~+T细胞非细胞杀伤功能。结果轻症和重症甲型H1N1流感患者PBMC中Notch受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)和Notch配体(DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2)mRNA相对表达量均高于对照组(P0.05)。重症甲型H1N1流感患者病毒特异性CD8~+T细胞分泌IFN-γ的细胞比例、分泌穿孔素和颗粒酶B的细胞数量均高于轻症患者(P0.05)。DPAT刺激抑制甲型H1N1流感患者病毒特异性CD8~+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的细胞比例以及分泌穿孔素和颗粒酶B的细胞数量(P0.05)。直接培养系统中,DAPT刺激均可降低病毒特异性CD8~+T细胞诱导的靶细胞死亡比例(P0.05),培养上清中TNF-α和IFN-γ水平均亦降低(P0.01)。间接接触培养系统中,虽然DAPT刺激后培养上清TNF-α和IFN-γ水平降低(P0.01),但CD8~+T细胞诱导的靶细胞死亡比例的差异在经DAPT刺激和无DAPT刺激之间的差异无统计学意义(P=0.149)。结论甲型H1N1流感患者中升高表达的Notch受体和配体可增强病毒特异性CD8~+T细胞的直接细胞杀伤功能,促进疾病进展。
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