甲基化特异性PCR技术优化试验

目的建立一种高特异性的甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)法。方法以p15基因为目的基因,以经亚硫酸氢盐转化的全甲基化人类基因组DNA及亚硫酸氢盐转化的全非甲基化人类基因组DNA为模版,采用Methprimer软件预测p15启动子甲基化岛并设计甲基化及非甲基化引物,对甲基化及非甲基化DNA模板进行聚合酶链式反应(PCR)。根据MSP的PCR阶段的退火温度分为普通温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为58、55℃)及提高温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为60、57℃)。在普通温度组的基础上,通过增加镁离子(Mg~(2+))浓度、添加PCR反应体系中二甲基亚砜(DMSO)以优化PCR反应体系。结果 MSP的PCR反应阶段,普通温度组出现了非特异性扩增产物,即假阳性及假阴性;提高温度组非特异性扩增减弱,特异性扩增同等降低。普通温度的优化PCR体系组非特异性扩增消失,可以完全消除假阴性及假阳性。结论设置普通退火温度同时适当地增加Mg~(2+)浓度及DMSO有利于保证MSP结果的特异性。