| 摘 要： | 目的探讨Cu~(2+)对小胶质细胞(MG)内自噬-溶酶体途径介导的Aβ寡聚体(Aβo)清除功能的调控作用及其机制。方法应用ELISA检测MG对Aβo的摄取和细胞内降解;应用Western蛋白印迹法及免疫荧光技术检测Cu~(2+)刺激下MG内自噬相关蛋白及溶酶体相关蛋白的表达变化;应用单荧光和双荧光质粒转染实验检测自噬体和自噬流变化;应用Lyso Tracker red荧光探针检测溶酶体体积改变。结果 (1) Cu~(2+)处理BV-2细胞后可导致Aβo清除(包括摄取和细胞内降解)障碍。(2)并引起自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ和自噬底物P62蛋白水平升高;GFP-LC3转染结果显示,Cu~(2+)刺激后自噬体数量增加。(3)溶酶体酸化抑制剂bafilomycin A1处理后,LC3-Ⅱ蛋白水平较赋形剂处理组明显升高,但bafilomycin A1+Cu~(2+)刺激未导致LC3-Ⅱ蛋白水平的进一步升高;自噬体形成抑制剂3-MA预处理后,Cu~(2+)仍可以增强LC3-II水平;提示Cu~(2+)可能是通过抑制溶酶体降解过程导致LC3-Ⅱ蛋白水平升高,即抑制自噬降解过程。(4) RFP-GFP-LC3质粒转染结果显示,Cu~(2+)可导致自噬流障碍。(5) Cu~(2+)可导致溶酶体LAMP1和总Cat B(包括pro Cat B和mature Cat B)表达下降,并降低溶酶体体积。(6) Cu~(2+)处理后,转录因子TFEB蛋白水平及其溶酶体相关靶基因的表达均有下调;(7) Cu~(2+)可增强m TOR及其底物蛋白p70S6k磷酸化水平,提示m TORC1可能参与了Cu~(2+)调控自噬及溶酶体功能的作用;(8)应用m TORC1抑制剂PP242预处理,可显著改善Cu~(2+)导致的LC3-Ⅱ和P62蛋白水平升高及自噬流障碍,TFEB及其靶基因表达下调,溶酶体生物合成及体积下降,以及Aβo清除障碍。结论Cu~(2+)可能通过m TORC1-TFEB通路抑制性调控MG自噬-溶酶体途径介导的Aβo清除;m TORC1抑制剂PP242可改善Cu~(2+)作用。
|
