hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-II基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长

 目的：设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子II（IGF-II）基因的小干扰RNA（siRNA）序列，构建由重组人甲胎蛋白（hAFP）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）双启动子调控的该siRNA表达载体，观察其对肝癌细胞生长的影响。方法：根据siRNA设计原则，参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列，转染人肝癌Huh7细胞，转染24 h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-II mRNA表达量变化，筛选干扰效率最高的siRNA序列。采用PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列，应用基因重组技术构建重组hAFP和hTERT双启动子调控的该siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及L-02人正常肝细胞，观察IGF-II mRNA表达及细胞生长情况变化。结果：实时荧光定量PCR显示，siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高，约90%。成功扩增hAFP及hTERT启动子核心序列，将其分别克隆入pGL3-Basic载体，构建成重组pGL3-hAFP-hTERT载体；将siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT载体，构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低，抑制效率达86%，细胞增殖受到明显抑制，G1期细胞比例显著增加；L-02细胞上述指标无明显改变。结论: 成功构建双重RNA聚合酶II启动子（hAFP及hTERT双启动子）调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体，即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3；该siRNA表达载体可特异性抑制IGF-II mRNA表达及肝癌细胞生长。

Human IGF-II siRNA driven by hAFP/hTERT dual promoters specifically suppresses growth of human hepatocellular carcinoma cells