Orexin-A通过激活OX1R、OX2R和非Ca2+依赖的PKC抑制新生大鼠脊髓腹角神经元的γ-氨基丁酸电流

目的 研究orexin-A对脊髓腹角神经元促离子型γ-氨基丁酸（GABA）受体功能的影响及其机制。方法 选取7~12 d的新生SD大鼠，麻醉后分离出含腰骶膨大的脊髓节段并切片。使用木瓜蛋白酶（Papain，0.18 g/30 mL人工脑脊液）消化切片并孵育40~60 min。显微镜下保留腹角，使用抛光的不同口径的巴斯德吸管急性机械分离单个细胞，待细胞贴壁后，应用膜片钳记录联合药理学方法对状态良好的神经元开展研究。在电压钳模式下记录，结合预处理给药方式，应用GABA受体激动剂γ-氨基丁酸记录在脊髓腹角神经元诱发的电流，给予orexin-A观察其对GABA电流的调制作用，先后给予OX1R选择性拮抗剂SB334867、OX2R选择性拮抗剂TCSOX229、PKC抑制剂Bis-IV、PKC激动剂PMA、PKA抑制剂Rp-cAMP、Ca2+螯合剂BAPTA等药物分析orexin-A对GABA电流调制的作用机制。结果 分离的脊髓腹角神经元形态良好，胞体形状多样，表面光洁，立体感较强且突起较长；给予orexin-A后，GABA诱发的电流幅值被显著制抑（P<0.001，n=49），抑制率为（67.48±12.50）%；同时给予SB334867和TCSOX229可完全取消orexin-A对GABA电流的抑制作用（P=0.93，n=6）；单独应用SB334867（P=0.001，n=8）或TCSOX229（P=0.02，n=8）均部分解除orexin-A对GABA电流的压抑作用；给予Bis-IV后，orexin-A不再压抑GABA电流（P=0.31，n=5）；PMA可模拟orexin-A的作用，显著抑制GABA电流，抑制率为（60.79±10.94）%，在此基础上，orexin-A不能进一步压抑GABA电流（P=0.15，n=6）。给予Rp-cAMP后，orexin-A仍可显著压抑GABA电流（P=0.001，n=5）。在无Ca2+细胞外液（P=0.004，n=8）或胞内应用BAPTA（P=0.04，n=7）时，orexin-A对GABA电流的压抑作用不受影响。结论 Orexin-A抑制脊髓腹角神经元的GABA电流，该效应可能经由OX1R和OX2R共同介导以及非Ca2+依赖的PKC信号通路的参与。