建立猪血管内皮细胞对人血清适应的模型及其评估

目的:观察人免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和正常人AB型血清诱导猪血管内皮细胞适应状态的效果。方法:实验于2002-05/2003-02在解放军第四军医大学分子生物学实验室完成。①正常人AB型血清和猪血清制备:取健康AB血型成年人血,每次50mL,置于干燥管内,垂直静置6h,3000r/min离心10min,取上清。操作4℃条件下进行,以保证补体的活性。获得血清于-20℃保存备用,用前0.22μm滤膜过滤除菌。猪血清制备同上。②猪血管内皮细胞培养、纯化及鉴定:取体质量3kg实验用乳猪,自左侧髂总动脉向心侧插入大隐静脉导管20cm,注射肝素500U后持续滴注含肝素抗生素盐水(肝素1×105U/L,青霉素4×107U/L),取腹主动脉和胸主动脉,以4℃含肝素抗生素盐水冲洗管腔和外膜后注入37℃预热的10g/LⅠ型胶原酶,消化5min后收集消化液,以1000r/min离心5min,收集细胞放于CO2孵箱内培养并传代,第3代以后不再使用抗生素。在光学显微镜下观察细胞生长形态,进行培养细胞类型的鉴定。③正常人血清对猪血管内皮细胞溶解试验:将猪血管内皮细胞制成浓度5×106L-1的细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔200μL,培养至第4天细胞基本铺满培养板底部后加入含正常人AB型血清的培养液,终浓度分别为5%、10%、25%、40%,以相应浓度猪血清为对照,每组各取3孔。放入37℃孵箱内孵育2h后以四唑盐比色试验测各孔的吸光度值。④猪血管内皮细胞对人血清适应模型的建立及评估:培养猪血管内皮细胞,分别以免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和低浓度正常人AB型血清诱导猪血管内皮细胞6d,以四唑盐比色法检测细胞存活率,并以免疫组化方法检测其血红素氧合酶1表达的情况。结果:①接种细胞形态呈圆形、三角形或短梭形,胞体丰满、胞浆均匀、核仁清晰。部分细胞呈团块样,大部分细胞为单细胞分布,其间混杂有少许血细胞,说明培养细胞为血管内皮细胞,无明显杂细胞污染。②在25%的正常人AB型血清作用下,猪血管内皮细胞的存活率为(71±22)%。与对照组相比较,100mg/L免疫球蛋白M和5%、10%正常人AB型血清诱导猪血管内皮细胞存活率分别为(81±31)%,(93±25)%,(90±42)%。③诱导后猪血管内皮细胞胞浆内血红素氧合酶1的表达明显增加。结论:100mg/L免疫球蛋白M和正常人AB型血清能够诱导猪血管内皮细胞的适应,后者效果更为明显。

Establishment and evaluation of porcine vascular endothelial cell models adaptive to human normal serum