Ⅰ型胶原三维立体支架高密度培养软骨细胞的增殖及其分泌功能

目的:观察体外Ⅰ型胶原三维立体支架培养软骨细胞形态、增殖能力及Ⅱ型胶原表达的变化,并与单层培养结果相比较。方法:实验于2004-09/12在中山大学附属第三医院中心实验室完成。选择2周龄健康雄性一级新西兰大白兔1只,体质量0.5kg。体外分离兔双侧股骨髁关节软骨细胞后行单层贴壁培养,细胞铺满单层后,分别将细胞悬液按2×106/L,2×107/L,2×108/L密度传代培养。选择生长状态良好的第2,3代细胞置于Ⅰ型胶原三维立体支架培养。分别通过相差倒置显微镜、流式细胞仪、电镜检查以及组织学染色及免疫组织化学染色,分析软骨细胞的表型、增殖速度等生物学性状变化情况。结果:①单层培养随着时间的延长,增殖速度逐渐减慢,第6代细胞增殖能力较第2代明显下降,出现树突状的细胞突起,表现出细胞老化的趋势。分泌Ⅱ型胶原的能力也逐渐减低,第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色胞浆内呈阳性反应,至第6代呈阴性。在以低密度传代培养时上述过程出现较快,而以高密度传代培养时软骨细胞形态改变延迟。②在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养时,软骨细胞大量增殖,能维持其细胞表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。扫描电镜观察到软骨细胞成团吸附于支架孔隙网壁,说明支架吸附性良好,与软骨细胞相容性好。结论:软骨细胞在体外单层培养会失去细胞表型,不能分泌Ⅱ型胶原,高密度培养能减缓该过程。而在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养,有利于维持软骨细胞的表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。因此,建议采用在三维立体支架内高密度培养软骨细胞,构建有功能的组织工程软骨。

Proliferation of chondrocytes cutured on three-dimensional high-density type Ⅰ collagen scaffolds and its secretion function