H2O2 下调 miR-21 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化影响的研究

目的探讨 H₂O₂ 诱导的 miR-21 下调对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的作用及机制。 方法取 MC3T3-E1 细胞系，培养传至第 7 代进行实验。取 MC3T3-E1 细胞，以不同浓度 H₂O₂（0、40、80、160、320 μmol/L）培养，经实时荧光定量 PCR 检测 miR-21 表达、MTS 法检测细胞活性，选择 H₂O₂ 最合适实验浓度。取 MC3T3-E1 细胞分为空白对照组（A 组）、H₂O₂ 组（B 组）、成骨诱导组（C 组）、H₂O₂+成骨诱导组（D 组），对应培养后实时荧光定量 PCR 检测 miR-21 表达以及成骨标志基因 Runx2、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）及Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ alpha 1，Col1a1）表达，Western blot 检测磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）蛋白表达，茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况，分析 H₂O₂ 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响。然后再取 MC3T3-E1 细胞，分为 H₂O₂ 组（A1 组）、H₂O₂+成骨诱导组（B1 组）、H₂O₂+miR-21 抑制剂+成骨诱导组（C1 组）、H₂O₂+miR-21 抑制剂阴性对照+成骨诱导组（D1 组）；以及 H₂O₂ 组（A2 组）、H₂O₂+成骨诱导组（B2 组）、H₂O₂+siRNA-PTEN 阴性对照+成骨诱导组（C2 组）、H₂O₂+siRNA-PTEN+成骨诱导组（D2 组）；对应培养后检测成骨标志基因（Runx2、OPN、Col1a1）表达以及细胞外钙基质沉积情况，分析下调 miR-21 或沉默 PTEN 对细胞成骨分化的影响。 结果结合实时荧光定量 PCR 检测以及 MTS 法结果，选择 160 μmol/L H₂O₂ 进行实验。第 1、2 周 B 组 miR-21 相对表达量低于 A 组（P<0.05），D 组低于 C 组（P<0.05）；第 2 周 C 组 PTEN 蛋白相对表达量均低于 A、D 组（P<0.05）；第 1、2 周 D 组 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相对表达量均低于 C 组（P<0.05），茜素红染色显示 D 组钙基质沉积少于 C 组。C1 组 PTEN 蛋白相对表达量高于 D1 组（P<0.05）；第 1、2 周 B1、D1 组 Runx2、OPN mRNA 相对表达量均高于 C1 组（P<0.05），第 2 周 B1、D1 组 Col1a1 mRNA 均高于 C1 组（P<0.05）；茜素红染色显示 C1 组钙基质沉积少于 B1、D1 组。第 1 周 D2 组 OPN、Col1a1 mRNA 相对表达量高于 B2、C2 组（P<0.05），第 3 周茜素红染色显示 D2 组钙基质沉积明显多于 B2、C2 组。 结论H₂O₂ 抑制 MC3T3-E1 成骨分化可能与 miR-21 下调有关。