| pCGN-HAM-N1-wcAPC质粒的构建及其功能 |
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| 引用本文： | 方喜平,冯茂辉,谢伟,王国洲,陈双倩,阳芳,柳琨,杨倩,陈大平.pCGN-HAM-N1-wcAPC质粒的构建及其功能[J].中华实验外科杂志,2013,30(10). |
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| 作者姓名： | 方喜平 冯茂辉 谢伟 王国洲 陈双倩 阳芳 柳琨 杨倩 陈大平 |
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| 作者单位： | 1. 恩施自治州中心医院肿瘤科,445000
2. 430071,武汉大学中南医院肿瘤外科肿瘤生物学行为湖北省重点实验室 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金资助项目，湖北省自然科学基金资助项目，湖北省卫生厅科研资助项目，武汉市科技攻关重点资助项目 |
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| 摘 要： | 目的 构建带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC及探讨其功能.方法 制备高效率感受态；用聚合酶链反应(PCR)扩增,将腺瘤息肉病(APC)基因截短的片段APC1克隆于T载体；同时将pCMV-neo-bam-APC酶切,得到APC基因的另一个8300 bp截短片段kAPC亚克隆于pCGN-HAM-N1真核表达载体,得重组质粒pCGN-HAM-N1-kAPC；再运用双酶Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ同时酶切TA克隆、pCGN-HAM-N1-kAPC,将APC1片段插入载体pCGN-HAM-N1-kAPC,获含野生型全长APC基因重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC.用酶切,测序鉴定.脂质体法分别将含全长,截短的重组质粒,空载体与WNT信号系统的β-连环蛋白(β-catenin)、topflash和荧光素酶共同转染293T细胞,利用双荧光报告测试系统,检测转染后荧光素酶活性.结果 重组质粒经酶切其大小与预期一致,经测序比对证实与GeneBank中给出的序列一致.转染pCGN-HAM-N1-wcAPC组的荧光素酶活性明显低于转染空载体组pCGN-HAM-N1(P＜0.05).结论 含野生型全长9000 bp大片段APC基因分段成功插入pCGN-HAM-N1载体,带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC构建成功,pCGN-HAM-N1-wcAPC抑制T细胞因子/淋巴增强因子(Tcf/Lef)启动子的活性.
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| 关 键 词： | 高效感受态 腺瘤息肉病基因 克隆 重组质粒 启动子 |
Construction of recombinant plasmid pCGN-HAM-N1-wcAPC and this plasmid inhibition of activation of T-cell factor/lymphocyte enhancer factor promoter |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Competent cells Adenomatous polyposis coli gene Clone Recombinant plasmid Promoter |
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