人软骨终板干细胞与退变髓核细胞体外非接触共培养的实验研究

目的:探究人软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)与退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)在Transwell非接触共培养条件下的相互作用。方法:对取自因腰椎退行性疾病行腰椎间盘切除椎弓根螺钉内固定患者的软骨终板、退变髓核进行CESCs及NPCs的分离培养及鉴定。通过琼脂糖悬浮培养法获得CESCs的克隆,扩增后行流式技术及免疫荧光对CESCs进行干细胞表面标记的检测,取第三代CESCs与第一代NPCs进行实验,建立三个细胞培养组:CESCs单独培养组、NPCs单独培养组、CESCs与NPCs共培养组(分别接种于Transwell底部和上层插槽中进行非接触共培养)。在培养之后的不同时间点(3、5、7d),采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测各组细胞中蛋白聚糖(Agg)、SOX-9及Ⅱ型胶原蛋白(CollⅡ)m RNA的表达变化情况,共培养7d后,采用Western-blot检测各组细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox-9蛋白的表达变化。结果:经过分离培养及鉴定,筛选出的细胞为CESCs(流式细胞计数分析,CESCs细胞表面的CD73、CD90、CD105阳性率分别为97.5%、98.7%、98.7%);共培养后,RT-PCR显示单独培养的CESCs在各检测时间点几乎无Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达;而共培养组的CESCs在第5天开始出现Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达(其表达量分别为0.10、0.11、0.15),与单独培养CESCs相比有统计学意义(P0.05);共培养组NPCs的Agg、CollⅡ及SOX-9基因表达量(其表达量分别为1.32、1.25、0.92)高于单独培养NPCs的表达量(P0.05),且随着时间延长逐渐升高,共培养与单独培养相比,差异有统计学意义(P0.05)。共培养7d后,Westernblot结果与RT-PCR结果一致,共培养组CESCs的Agg、CollⅡ、SOX-9蛋白表达量高于单独培养组(P0.05)。结论:CESCs与NPCs共培养时的相互作用能促使CESCs表达髓核细胞特异性标记物Agg、CollⅡ和SOX-9;通过相互作用,CESCs可增强NPCs表达自身特异性相关分子。

An in vitro study on the interaction of human cartilage endplate stem cells with nucleus pulposus cells in co-culture system