| 摘 要： | 目的建立不同分子作用机制的糖皮质激素受体α(GRα)调节剂高通量筛选模型,筛选新型糖皮质激素受体调节剂。方法克隆GRα的配体结合域LBD和全长基因,构建哺乳动物细胞表达载体pBIND-GAL4-GRαLBD、pTARGETGRα,分别与已构建的含GAL4响应元件5×UAS的荧光素酶报告质粒p5×UAS-luc和含有4×GRE的报告质粒pGRE-luc共转染HeLa细胞,建立两种不同机制的报告基因细胞筛选方法,通过报告基因的表达检测化合物对GRα受体转录调控功能的调节剂作用;利用实时定量PCR方法进一步验证化合物对糖皮质激素受体靶基因mRNA水平的调控作用。结果经过分别共转染表达质粒和报告质粒,GRα激动剂地塞米松可剂量依赖地诱导5×UAS-luc和4×GRE-luc两个模型的荧光素酶的表达,在5×UAS-luc模型中,最大上调倍数可达(9.0±0.2)倍,EC50值为(0.28±0.07)mmol/L,Z’因子为0.52。在4×GRE-luc模型中,最大上调倍数可达(3.2±0.3)倍,EC50值为(1.81±0.13)mmol/L,Z’因子为0.49。利用模型pBIND-GAL4-GRαLBD/p5×UAS-luc从2000多个微生物和植物来源的天然以及合成化合物中筛选得到1个微生物来源的天然产物黑麦酮酸D,黑麦酮酸D对GRα具有2~3倍的激动活性。进一步的定量PCR的结果说明黑麦酮酸D能有效上调多个GRα调控的靶基因的表达。结论两种报告基因筛选方法灵敏、稳定,可以用于GRα调节剂的高通量筛选。
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