人CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化及活性测定

目的对原核体系表达的CaMKKβ蛋白体外活性进行探索,为针对CaMKKβ、AMPK药物研发提供科研基础。方法克隆人CaMKKβ基因,建立原核表达载体pET28a-CaMKKβ,将其转化入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞内,在16℃、0.02 mmol/L IPTG条件下诱导重组表达CaMKKβ蛋白,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白,并利用Glo?Max Assay方法检测其活性。结果通过基因测序表明pET28a-CaMKKβ质粒构建成功;重组人CaMKKβ蛋白可溶性表达量较高,Ni-NTA纯化6His-CaMKKβ蛋白纯度可达80%以上,活性检测结果表明,大肠杆菌体系内表达的人CaMKKβ蛋白在CaM/Ca2+存在与否情况下,酶活基本一致。结论成功构建原核表达载体pET28a-CaMKKβ,实现重组人CaMKKβ在原核体系内可溶性表达,活性测定表明原核体系内表达的CaMKKβ自主酶活性较强,受CaM/Ca2+影响较小。