结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1shRNA表达质粒对肝星状细胞细胞因子表达及细胞外基质分泌的影响

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的短发夹RNA(shRNA)表达质粒分别及共转染肝星状细胞(HSC)对CTGF、TIMP-1、I型前胶原(PCI)mRNA表达及细胞外基质(ECM)分泌的影响. 方法 筛选并成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1有效RNA干扰靶位的shRNA表达质粒,分别及共转染转化生长因子β1刺激活化的大鼠HSC-T6细胞,荧光定量PCR检测各组细胞中CTGF、TIMP-1、PCI mRNA的表达;放射免疫法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)和层黏连蛋白(LN)的含量.组间比较采取方差分析;多组间两两比较采用SNK-q检验. 结果 CTGFshRNA转染和双质粒共转染HSC-T6的CTGFmRNA相对表达量分别为0.59±0.03、0.62±0.01,与空白对照组、CTGFshRNA转染组的1和1.00±0.07比较,CTGF mRNA表达量均明显下降,F=66.515,P值均＜0.05,差异有统计学意义;而TIMP-1 shRNA组和双质粒共转染组的TIMP-1 mRNA相对表达量分别为0.66±0.04、0.68±0.03,与空白对照组、CTGFshRNA转染组的1和1.05±0.03比较,TIMP-1 mRNA表达量均明显下降,F=83.835,P值均＜0.05,差异有统计学意义;CTGFshRNA转染、TIMP-1shRNA转染和共转染组的PCI rnRNA相对表达量分别为0.55±0.02、0.57±0.02和0.41±0.01与空白对照组的1比较,PC I mRNA表达量均明显下降,F=709.905,P值均＜0.05,差异有统计学意义;双质粒联合转染对CTGF、TIMP-1、PC I的mRNA表达量抑制作用优于单质粒转染.CTGF shRNA转染、CIGF shRNA转染和双质粒共转染组的PCⅢ含量分别为(78.02±6.50) ng/ml、(79.03±5.47) ng/ml、(53.91±4.01)ng/ml,与空白对照组的(113.79±15.88)比较,PCⅢ含量均明显下降,P值均＜0.05,差异有统计学意义; CTGF shRNA转染、CTGF shRNA转染和双质粒共转染组的HA含量分别为(127.36±8.33)ng/ml、(116.55±3.37) ng/ml、(82.84±9.03) ng/ml,与空白对照组的(163.10±7.01)ng/ml比较,HA含量均明显下降,P值均＜0.05,差异有统计学意义CTGFshRNA转染、CTGF shRNA转染和双质粒共转染组的LN含量分别为(55.41±9.37)ng/ml、(49.77±6.70) ng/ml、(30.72±1.22) ng/ml,与空白对照组的(83.99±4.67) ng/ml比较,LN含量均明显下降,P值均＜0.05,差异有统计学意义.CTGF shRNA与TIMP-1 shRNA双质粒联合转染对PCⅢ、HA、HA分泌的抑制作用优于单质粒转染.结论 CTGF shRNA.TIMP-1 shRNA可明显抑制HSC的CTGF、TIMP-1、PCI基因表达及ECM的分泌,且shRNA联合干扰效果更显著,有望成为抗肝纤维化基因治疗的有效方法.

Effect of shRNA-mediated silencing of CTGF and TIMP-1 on mRNA expression of CTGF, TIMP-1, and PCI and secretion of extracellular matrix in rat hepatic stellate cells