人脐血间充质细胞体外分离培养方法及培养基特性

目的:采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质细胞的方法。方法:实验于2003-11/2004-10在郑州大学医学院干细胞中心完成。选择郑州大学医学院第三附属医院产科足月妊娠健康产妇的脐血用于实验(产妇均签署知情同意书),随机分为4组:低糖DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)组、高糖DMEM组、低糖DMEM+干细胞因子组、MsencultTM(一种特殊成分的液体培养基,与其添加物配合使用可促进间充质干细胞分化为脂肪细胞)组。待新生儿娩出后,立即断脐,消毒母侧脐带断端,60mL无菌注射针穿刺脐静脉取血,立即导入肝素抗凝的无菌采血袋内。取新鲜采集的脐带血,用1.077g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,将脐血单个核细胞接种于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化。结果:①各组间充质细胞培养24h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较:MsencultTM组、低糖DMEM+干细胞因子组的贴壁细胞数明显多于高糖DMEM组、低糖DMEM组(40.5±9.7),(31.5±4.2),(14.0±1.4),(7.5±1.6)个,P<0.05],细胞存活率亦明显高于高糖DMEM组、低糖DMEM组(97.1±0.9),(95.3±2.6),(84.1±1.9),(81.2±1.1)%,P<0.05]。②各组间充质细胞在不同培养时间下生长状态的比较:培养第3,7,10,14天MsencultTM组、低糖DMEM+干细胞因子组细胞增殖的速度均快于高糖DMEM组、低糖DMEM组(P<0.05),且MsencultTM组细胞克隆数最多(1±1.22),(0.83±0.75),(0.2±0.4),0个,P<0.05]。结论:采用低糖DMEM+干细胞因子与单纯MesencultTM培养基培养的细胞生长旺盛,但由于干细胞因子用量较大,价格昂贵,因此低糖DMEM联合应用干细胞因子的方法并不十分适用。而MesencultTM为酸性培养基,有利于脐血细胞的生长,并可形成克隆,为脐血间充质细胞的成功培养创造了条件,是一种适合脐血间充质细胞生长的培养基。

Cultured method of cord blood-derived mesenchymal cells in vitro and characters of culture medium