多联袋无菌制备脐带血间质干细胞的方法及效果

目的:分析人脐带血间质干细胞分离培养方法及临床应用的安全性。方法:实验于2005-04/12在河南省红十字血液中心和郑州市第二人民医院完成。实验方法:①无菌条件下将脐带血液采集到无菌采血袋内,产妇及其家属均知情同意,并经医院伦理委员会批准。随机抽查62份样本,单份采集量80～160mL,计数有核细胞。②以1:1体积比将Ficoll-Hypaque混合溶液加入四联袋主袋内,将四联袋与脐带血收集袋相连,再将样本血液沿袋壁缓慢加入四联袋主袋内的液面上。离心后将四联袋主袋放在分浆夹上,袋内液体自上而下分为血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层5层。将血浆血小板层上2/3液体挤压入四联袋一空袋内,将剩余的血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层上部挤压入四联袋另一空袋内,即为富含有核细胞液体。③随机选择本院2005-04/12收治脑卒中后遗症患者10例。男9例,女1例,35～75岁,病程3个月～7年。诊断均由CT、MRI检查证实,符合第四届全国脑血管病学术会议修订的脑卒中诊断标准,患者均对治疗方案知情同意。将脐带血间充质干细胞经静脉输注入患者体内,每次输注1份,每例患者平均输注6份,每份间隔时间平均4d。于治疗前和治疗3个月后评价患者神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力。采用脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准评估神经功能,分数越低,神经功能状态越好;采用Fugl-Meyer评估患侧肢体运动功能,分数越高,肢体运动功能越好;采用Barthel指数评估日常生活活动能力,分数越高,日常生活活动能力越高。结果:①分离的62份脐血间质干细胞,每份含有有核细胞(3.62±2.39)×109,红细胞残余量为(1.64±1.25)×109,CD34 细胞的比率为(2.31±0.93)%,CD133 的比率为(1.36±1.23)%。培养7d后贴壁细胞为(3.27±1.85)×107,CD133 比率为(8.21±2.46)%。②患者治疗前与治疗3个月后相比,神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力评分均明显升高(治疗前:25.40±6.09,31.90±21.85,36.20±19.41;治疗后:1.90±5.09,80.9±25.00,81.10±15.93,P<0.01)。未发现免疫排斥及不良反应。结论:①利用多联袋无菌制备脐血间质干细胞分离效果良好,分离过程在密闭系统进行,单个核细胞和间质干细胞能满足临床需要,适合患者静脉输注和局部直接应用,方法简便安全可靠。②经静脉输注后,疗效确切,能明显改善脑卒中后遗症作用。

Sterile preparation of umbilical cord derived mesenchymal stem cells with multiple bags:Method and effect