IL-12双亚基共表达载体的构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

 目的 构建人 IL-12（hIL-12）p40 和 p35 双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法 根据 hIL-12 p40 和 p35 亚基全长 cDNA 序列分别设计合成引物行 PCR 扩增，将扩增所得 p40 和 p35 片段采用 overlap PCR 法拼接，获得的 rhIL-12 融合基因与 pGEM-T Easy 质粒连接，将鉴定正确的 pGEM-T/rhIL-12 重组质粒克隆至 pcDNA3.1（+）真核表达质粒中，构建 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 真核表达载体，并进行测序鉴定。将鉴定正确的 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 经脂质体介导转染 hMSC，同时以转染 pcDNA3.1（+）空质粒作为对照组，在倒置显微镜下观察细胞生长形态；在转染后第 4 天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达；另分别在转染后第 2、4、6、8、10、12、14 天，采用 ELISA 方法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达水平。 结果 PCR 扩增结果显示特异性扩增出 p40（1000 bp）、p35（600 bp）、rhIL-12（1600 bp）片段，均与预期 DNA 表达片段大小一致。pcDNA3.1（+）/rhIL-12 测序显示克隆的 rhIL-12 基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察，可见转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 生长形态和生长速度与对照组 hMSC 相比均无明显差异。蛋白质印迹和 ELISA 检测显示，转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 培养上清液中可见 rhIL-12 融合蛋白的持续表达；而对照组中均未检测到 rhIL-12 融合蛋白表达。 结论 成功构建了 hIL-12 p40 和 p35 双亚基真核共表达载体 pcDNA3.1（+）/rhIL-12，为利用 hIL-12 进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。