| 摘 要： | 目的重组表达人细胞色素P450(CYP)2A13突变体CYP2A13*2,CYP2A13*5,CYP2A13*6,CYP2A13*8和CYP2A13*9,并研究CYP2A13突变体与野生型CYP2A13(CYP2A13*1)对香豆素的代谢活性上的差异。方法通过点突变法构建各CYP2A13突变体。用杆状病毒表达系统制备含各突变体c DNA的重组病毒,并将其与含人源还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸P450氧化还原酶(POR,野生型)的重组杆状病毒共转染昆虫草地夜蛾细胞(sf9),共表达CYP2A13突变体和POR重组蛋白。将表达产物制备成微粒体与香豆素(0.25~25μmol·L-1)体外孵育30 min,高效液相色谱法测定各重组酶对香豆素的代谢活性。结果Western蛋白印迹结果表明,各重组酶在sf9细胞中得到了表达。体外代谢实验显示,CYP2A13野生型及其突变体蛋白代谢香豆素在Km值上无显著差异,而在Vmax(mol·min-1·mol-1CYP)上,CYP2A13*2(0.58±0.05,P<0.05)、CYP2A13*5(0.71±0.08,P<0.01)、CYP2A13*6(0.84±0.09,P<0.01)、CYP2A13*9(0.58±0.04,P<0.05)等突变体与CYP2A13*1(0.33±0.06)相比有显著性差异,使得这4个突变体的代谢效率增加了40%~108%。结论体外成功表达了具有活性的CYP2A13*2,CYP2A13*5,CYP2A13*6,CYP2A13*8和CYP2A13*9重组蛋白。CYP2A13*2,CYP2A13*5,CYP2A13*6和CYP2A13*9等突变体的香豆素代谢活性明显高于CYP2A13*1。
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