左归丸药物血清对骨髓间质细胞转化为肝细胞的作用

目的:一些实验已证实骨髓干细胞可以向肝细胞横向分化,观察补肾中药左归丸含药血清对骨髓间质细胞分化为肝细胞的影响。方法:实验于2002-01/2004-12在湖北中医学院附属医院肝病研究所完成。①实验动物:选取SPF级纯系Wistar大鼠46只,1只用于骨髓间质细胞的分离及培养,剩余45只用于含药血清的制备。另取2d龄Wistar乳鼠20只,用于肝脏细胞的培养。②实验方法:以体外肝细胞培养上清为诱导条件培养液,采用贴壁分离法纯化大鼠骨髓间质细胞。45只Wistar大鼠依次取15只用生理盐水、中药左归丸(由熟地、淮山药、枸杞子、山茱萸、菟丝子、川牛膝、鹿角胶、龟版胶组成)浓缩煎剂、中药八珍汤(由人参10g,白术10g,茯苓10g,甘草6g,当归15g,川芎10g,白芍15g,熟地15g组成)浓缩煎剂按10mL/kg灌胃,灌胃量以生药10g/kg计算,1次/d。第15天灌胃后2h,腹腔麻醉颈动脉插管取血,分管盛装含药血清,放置备用。大鼠骨髓间质细胞传至6代,分6组诱导培养:常规培养组使用常规培养液(DMEM培养液 体积分数为0.2的胎牛血清 2mmol/L谷氨酸胺)进行培养;肝细胞生长因子诱导组以常规培养液 25μg/L肝细胞生长因子 10-7mol/L地塞米松进行培养;肝细胞生长因子加左归丸组以常规培养液 25μg/L肝细胞生长因子 10-7mol/L地塞米松 10%左归丸含药血清进行培养;条件培养液加对照血清组以常规培养液 50%条件培养液 10%正常大鼠血清进行培养;条件培养液加八珍汤组以常规培养液 50%条件培养液 10%八珍汤含药血清进行培养;条件培养液加左归丸组以常规培养液 50%条件培养液 10%左归丸含药血清进行培养。③实验评估:诱导28d,每组10个复孔,分别于诱导第0,7,14,21,28天免疫细胞化学法检测肝细胞标志物甲胎蛋白、细胞角蛋白18及白蛋白阳性细胞率,PAS染色检测糖原阳性细胞率。结果:①诱导第0天,各组甲胎蛋白、白蛋白阳性细胞呈极少数表达(t=0.44～1.90,P>0.05),细胞角蛋白18及糖原均未见阳性细胞表达。②肝细胞生长因子加左归丸组、条件培养液加左归丸组在诱导第7,14,21,28天白蛋白、细胞角蛋白18、糖原的阳性细胞率均显著高于其他4组(t=5.42～55.00,P<0.05);甲胎蛋白阳性细胞率于诱导第7天时增高显著(t=55.00,P<0.05),此外各时间点又明显降低。③与肝细胞生长因子加左归丸组比较,条件培养液加左归丸组白蛋白阳性细胞率在诱导第14,21,28天时显著升高(t=4.06～7.49,P<0.05);甲胎蛋白阳性细胞率在诱导第7天时显著升高(t=83.69,P<0.05),至诱导第14,21,28天则明显下降(t=55.53～83.00,P<0.05)。结论:左归丸含药血清能够影响骨髓间质细胞向肝系细胞转化过程中的肝细胞标志物,从而提高骨髓间质细胞向肝细胞的转化率。

Effect of Zuogui Wan drug serum on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes