氧化应激条件下miR-21对人眼小梁网细胞胞外基质蛋白表达的影响

目的 探讨氧化应激条件下miR-21对人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cells,HTMCs)胞外基质蛋白表达的影响.方法 用不同浓度H2O2(0μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1、600 μmol·L-1)刺激HTMCs l h,MTT法检测其对HTMCs活力的影响,从而确定后续实验所需H2O2浓度.随后将细胞分成正常组和H2O2组,Real-time PCR检测miR-21的表达,Western blot检测胞外基质蛋白(纤维连接蛋白和胶原蛋白I)的表达.然后将细胞分成5组:H2O2组(只用H2O2处理)、miR-21干预组(H2O2+ miR-21模拟物)、miR-21对照组(H2O2+ miR-21对照模拟物)、miR-21抑制组(H2O2+ miR-21抑制剂)和miR-21抑制对照组(H2O2+miR-21抑制剂对照物),Real-time PCR检测miR-21、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β2和PTEN mRNA表达,Western blot检测胞外基质蛋白、TGF-β2和PTEN蛋白表达.最后将细胞分成3组:H2O2组(只用H2O2处理)、PTEN干扰组(H2O2 +PTEN siRNA)和干扰对照组(H2O2+ control siRNA),检测PTEN、胞外基质蛋白和TGF-β2蛋白水平表达.结果 当H2O2浓度≥400 μmol·L-1时,可显著抑制HTMCs的活性,后续实验选择此浓度.与正常组相比,H2O2组中miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ的表达均增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).检测氧化应激条件下miR-21对胞外基质蛋白、TGF-β2和PTEN表达的影响,发现与H2 O2组相比,miR-21对照组和miR-21抑制对照组中miR-21、纤维连接蛋白与胶原蛋白Ⅰ蛋白水平表达以及TGF-β2和PTEN mRNA及蛋白水平表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05);与miR-21对照组相比,miR-21干预组miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ蛋白水平及TGF-β2 mRNA和蛋白水平表达均增加,PTEN蛋白水平表达降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.05),而PTEN mRNA表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05);与miR-21抑制对照组相比,miR-21抑制组miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ蛋白水平及TGF-β2 mRNA和蛋白水平表达均降低,PTEN蛋白水平表达增加,差异均有统计学意义(均为P＜O.05),而PTEN mRNA水平差异无统计学意义(P＞0.05).采用Western blot检测氧化应激条件下PTEN对TGF-β2和胞外基质蛋白表达的影响,发现与H2O2组相比,干扰对照组PTEN、TGF-β2、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ的表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05);与干扰对照组相比,PTEN干扰组PTEN的表达下调,TGF-β2、纤维连接蛋白和胶原蛋白Ⅰ的表达均升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 氧化应激条件下miR-21可增加HTMCs胞外基质产物,这可能与其靶向沉默PTEN基因,调节TGF-β2的表达相关.

Effects of miR-21 on protein expression of extracellular matrix in human trabecular meshwork cells under oxidative stress