| DNMT3a基因shRNA质粒表达载体的构建及其沉默作用 |
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| 引用本文： | 吴艳凤,李德涛,郑倩,李雪,薛成军,陈辉.DNMT3a基因shRNA质粒表达载体的构建及其沉默作用[J].中国老年学杂志,2015(6):1612-1615. |
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| 作者姓名： | 吴艳凤 李德涛 郑倩 李雪 薛成军 陈辉 |
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| 作者单位： | 重庆医科大学附属第一医院检验科 |
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| 基金项目： | 重庆市自然科学基金(cstc2012jj A10105);重庆市卫生局医学科研计划项目(No.2012-2-016) |
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| 摘 要： | 目的以DNMT3a mRNA保守序列为靶基因设计针对DNMT3a mRNA的siRNA序列和无效干扰对照序列(HK),并利用基因重组技术将其克隆到真核表达载体p Gensil-1中,构建p Genesil-1-DNMT3a-shRNA、p Genesil-1-HK-shRNA重组质粒。方法应用转化技术将重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中,通过卡那霉素抗性筛选出阳性菌落后提取质粒进行酶切和测序鉴定,应用质粒转染技术转染耐顺铂肺腺癌A549细胞(A549-DDP),利用RT-PCR技术检测转染重组质粒24、48、72 h后DNMT3a的沉默效率。结果测序结果与合成序列一致,重组质粒不能够被PstⅠ切开,转染p Genesil-1-DNMT3a-shRNA能够明显抑制DNMT3a的表达,抑制率分别达到25.5%,56.2%,63.4%,且呈明显时间依赖性,而p Genesil-1-HKshRNA无明显抑制作用。结论成功构建了DNMT3a基因shRNA及HK质粒真核表达载体,为进一步实验研究奠定了基础。
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| 关 键 词： | DNMT3a RNA干扰 小发卡RNA 重组质粒 A549-DDP细胞株 |
Construction of the eukaryotic expression vector of DNMT3a shRNA and verification of its effect on silencing |
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| Institution: | WU Yan-Feng;LI De-Tao;ZHENG Qian;Clinical Laboratories,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University; |
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