补阳还五汤对脂多糖诱导的巨噬细胞RAW264.7重度内质网应激Caspase12、Fas-Fasl、Bcl-2信号通路的影响

目的:研究补阳还五汤对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞RAW264.7重度内质网应激(ERS)的抗凋亡作用及其机制。方法:Western bolt法检测不同浓度、不同时间LPS诱导下巨噬细胞RAW264.7 ERS的标志蛋白GRP78的表达,建立重度ERS模型。将细胞分别分为空白对照组(20%胎牛血清)、模型对照组(20%胎牛血清+LPS 40μg/ml)、空白血清组(20%空白血清+LPS 40μg/ml)、15 g/kg补阳还五汤5%、10%、20%含药血清组、2 mmol/L 4-苯基丁酸组、2 mmol/L 4-苯基丁酸联合15 g/kg补阳还五汤20%含药血清组。用流式细胞术、荧光素FITC标记的AnnexinV与碘化丙啶(PI)结合染色检测细胞凋亡情况。Western bolt检测补阳还五汤含药血清对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7重度ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、内切核糖核酸酶肌醇需要酶1(IRE1)表达的影响。用RT-PCR实验方法检测补阳还五汤含药血清对凋亡通路中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(Caspase12)、Fas、Fas配体(Fasl)、B-淋巴细胞瘤2(Bcl-2)表达的影响。结果:与空白对照组比较,模型对照组早凋率、晚凋率及总凋亡率均显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,15 g/kg补阳还五汤10%、20%含药血清组与2 mmol/L 4-苯基丁酸组均能明显降低重度ERS时引起的细胞凋亡(P<0.01);与空白对照组比较,模型对照组GRP78、IRE1、PERK蛋白表达均有显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,15 g/kg补阳还五汤各含药血清组可不同程度降低GRP78的蛋白表达(P<0.05或P<0.01),15 g/kg补阳还五汤10%、20%含药血清组可不同程度下调PERK、IRE1的蛋白表达(P<0.01);2 mmol/L 4-苯基丁酸组可有效下调GRP78、IRE1、PERK的蛋白表达(P<0.01);与空白对照组比较,模型对照组中Caspase12、Fas、Fasl的mRNA表达显著上调(P<0.01),Bcl-2的mRNA表达显著下调(P<0.01);与模型对照组比较,补阳还五汤各含药血清组及2 mmol/L 4-苯基丁酸组能显著下调Fas的mRNA表达,上调Bcl-2的mRNA表达,15 g/kg补阳还五汤10%、20%含药血清组能显著下调Caspase12、Fasl的mRNA表达(P<0.05或P<0.01)。结论:补阳还五汤改善巨噬细胞RAW264.7重度ERS的状态,通过Caspase12、Bcl-2、Fas-Fasl信号通路调控细胞在重度ERS状态下出现的细胞凋亡。

Effects of Buyang Huanwu Decoction on caspase12, Fas-Fasl and Bcl-2 signaling Pathways in Lipopolysaccharide Induced Severe Endoplasmic Reticulum Stress of RAW264.7 Macrophages