| 摘 要： | 目的构建腺病毒载体使其携带血管紧张素转换酶(ACE)基因短发夹RNA(shRNA),通过RNA干扰技术选择性地下调大鼠血管内皮细胞(ECs)ACE表达。方法采用RT-PCR法从之前构建的真核表达载体p-ACE-shRNA中扩增ACE-shRNA片段,扩增之后将ACE-shRNA片段克隆进pDC316穿梭质粒,再将293细胞被构建好的pDC316-ACE-shRNA穿梭质粒载体和pBHGlox-E1,3Cre骨架病毒转染,进行病毒颗粒包装重组并进行滴度测定和纯化。随后进行原代培养大鼠血管ECs转染,通过实时荧光定量PCR法分别在转染前及转染后24h、48h、72h通过实时荧光定量PCR法来检测ACE mRNA的表达。结果高滴度的重组病毒被制备完成,携带ACE-shRNA的重组腺病毒载体经PCR检测、限制性内切酶和GFP表达证实构建成功,被转染24h时大鼠血管ECsACE mRNA表达无统计学意义变化;但被转染48h时,ECsACE mRNA表达差异有统计学意义(P0.05);被转染后72h时表达更低。结论实验成功构建重组腺病毒载体并携带ACE-shRNA片段,同时证实shRNA可选择性下调原代培养大鼠血管ECs上ACE表达,可能为心血管病基因治疗和应用提供新思路。
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