小叶女贞糖基转移酶基因的克隆和原核表达研究

根据前期小叶女贞转录组研究的结果,利用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)从叶片中克隆到1条编码糖基转移酶的基因(xynz UGT)。该基因c DNA全长1 598 bp,由66 bp 5'-UTR,1 440 bp ORF,92 bp 3'-UTR组成,其中ORF编码1条含480个氨基酸残基的酶蛋白(xynz UGT),其相对分子质量和等电点分别为54 826.67 Da和5.82。利用生物信息学方法分析酶蛋白的结构,结果表明在一级结构中含有一段糖基转移酶高度保守的PSPG盒,在二级结构中含有α螺旋(38%)、β折叠片(12.1%)和无规蜷曲(49.9%),在三级结构中由肽链折叠形成2个正对的α/β/α类Rossmann折叠区域,并且两者之间夹着一个底物结合口袋。通过系统进化树分析发现,xynz UGT有可能催化酪醇等苯丙素类物质发生糖基化,进一步开展酶蛋白与酪醇的分子对接模拟实验,结果显示位于结合口袋的Gly138和Ser285通过氢键与酪醇发生相互作用。SDS-PAGE电泳分析表明,原核表达系统成功表达出相对分子质量为58 370.57 Da的xynz UGT重组蛋白,但它以非可溶性的包涵体形式存在。利用分子伴侣和酶蛋白共表达的方法,在一定程度上可促进酶蛋白的可溶性表达。以上研究结果为进一步开展体外酶促反应研究,并阐明酶的功能机制奠定了基础。