人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的建立

目的：建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库，通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞，体外经ＧＭＣＳＦ和ＩＬ４培养，扩增出高纯度的ＤＣ，抽提纯化ｍＲＮＡ，转录成ｃＤＮＡ，定向插入ｐＳＰＯＲＴ２０载体，建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ质粒文库；用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行随机测序，将得到的ＥＳＴ在ＳｕｎＥ４５０服务器中与ＥＭＢＬ及Ｓｗｉｓｐｒｏｔ数据库进行同源性比较，筛选出代表未知基因ＥＳＴ，然后在ＧＣＧ软件中进行分析，对重要的未知ＥＳＴ克隆其全长ｃＤＮＡ。结果：所扩增的ＤＣ经流式细胞仪分析高表达ＭＨＣⅠ、ＭＨＣⅡ、Ｂ７、ＣＤｌａ和ＣＤ８３等表面标志，能强烈刺激同种异体Ｔ淋巴细胞的体外增殖反应；建立的ＤＣｃＤＮＡ文库９２％以上克隆有平均１６ｋｂ大小的插入片段；从所测的１２０００余条ＥＳＴ中筛选出代表未知基因的３０００余条，克隆到１０９条全长新基因，包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子，部分全长基因已在Ｇｅｎｅｂａｎｋ中登录。结论：成功建立了人ＤＣ的ｃＤＮＡ基因文库及其大规模随机测序体系，并克隆到免疫分子。

Establishment of large scale sequencing system for the cDNA library of human dendritic cells