E1A激活基因阻遏子蛋白与细胞膜受体IGF2R（11～13）结构域作用抑制人血管平滑肌细胞迁移

目的 研究人E1A激活基因阻遏子基因(CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞迁移中的作用.方法 构建含有myc和His标签的野生型CREG(wtCREG)和去糖基化突变型CREG(mCREG)真核表达载体pcDNA3.1myc-His/wt/mCREG.转染人293F细胞株,Ni-NTA亲合层析方法纯化获得wtCREG和mCREG蛋白;将重组wtCREG(400 nmol/L)及mCREG蛋白(400 nmol/L),分别加入体外培养的低表达CREG的人血管平滑肌细胞OB2中,应用Western blot、细胞刮伤实验、明胶酶电泳方法观察两种重组人CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和分化等生物学行为的影响;通过不同浓度(2、4、8 mg/L)的胰岛素生长因子2受体(M6P/IGF2R)中和抗体与人M6P/IGF2R细胞外结构域蛋白小肽分别进行阻断实验,分析M6P/IGF2R是否参与介导CREG蛋白对平滑肌细胞迁移的调控.结果 刮伤实验发现,加入最佳效应浓度的wtCREG和mCREG蛋白24h后,OB2组细胞的迁移能力均明显下降;明胶酶电泳和Western blot检测结果也证实,两种重组CREG蛋白均可以使细胞外基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的合成及活性减少,而组织金属蛋白酶抑制物表达则明显增加;同时,Western blot分析也证实,平滑肌细胞分化标志蛋白myocardin、SM α-actin、肌球蛋白重链和caldesmin表达增加,LM-1和FN表达减少.提示两种重组CREG蛋白均能够抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移,促进其分化.IGF2R中和抗体和IGF2R小肽阻断实验证实:不同浓度的Anti-M6P/IGF2R能有效阻断两种CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质合成的调控作用.并且,M6P/IGF2R的第11 ～13结构域小肽片段对wt/mCREG蛋白的生物学效应也有明显的阻断作用.结论 重组CREG蛋白可能通过细胞膜表面M6P/IGF2R的11 ～13结构域抑制人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质分泌,维持细胞分化.

Cellular Repressor of E1A-stimulated Genes Inhibits the Migration of Human Vascular Smooth Muscle Cells via Binding of the M6P/IGF2R (11-13) Domains