外源HCV核心基因表达载体在HepG2中蛋白表达的亚细胞定位

目的研究HCV全长（天然）核心蛋白（C蛋白）和成熟C蛋白在HepG2细胞内的亚细胞定位，为进一步研究C蛋白与宿主细胞蛋白因子相互作用提供实验依据。方法设计HCV全长和成熟核心基因引物，以pBRTM／HCV1-3011为真核表达载体为模版行PCR；将PCR扩增产物酶切纯化后定向插入pEGFP-C1的BeglⅡ和EcoRⅠ位点，得到能表达全长HCV核心蛋白（C191aa．）和成熟核心蛋白（C173aa．）的真核表达载体pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173；将扩增pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173质粒转染到HepG2细胞中，28h、5d在荧光显微镜下观察两种C蛋白的亚细胞定位。5d后再用免疫细胞化学法观察两种C蛋白在HepG2细胞中着色现象。结果HCV核心基因PCR产物和构建的pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173经扩增测序证实。pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞28h后融合荧光全长C蛋白C191主要出现在核膜和胞质中，少部分出现在胞核及其膜中；而pEGDP-C1-C173转染HepG2细胞28h后主要定位在核中和核膜上。但pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞5d后，其表达的融合荧光蛋白主要出现在核内和核膜上，少量在胞质中；而成熟C蛋白C173则仍然在胞核内及核膜上。pEGDP-C1-C转染HepG2细胞5d后进行免疫细胞化学显示，C191蛋白和C173蛋白主要在核中、核膜着色，胞质有少量着色。结论HCV全长C蛋白的亚细胞定位是一动态过程，先出现在胞质中和核膜上，最后定位在核中和核膜上；成熟C蛋白主要定位在核中和核膜上。这种现象为解释瞬时转染HCV不同长度C基因对p53／p21通路作用出现相反结果奠定基础。

Construction of HCV core genes eukaryotic expression vectors and subcellular localization of the proteins in HepG2 cells