在人子宫内膜饲养层上生长的人原始生殖细胞生物学特性

背景:目前在胚胎多潜能干细胞建系和培养过程中,存在着建系率低、具有正常核型的干细胞系比率低等问题.目的:观察接种于人子宫内膜成纤维细胞饲养层上原代培养的人原始生殖细胞在体内外的生物学特性.设计、时间及地点:细胞观察,于2004-01/2005-04在沈阳市妇婴医院和中国医科大学完成.材料:人胚胎来源于流产孕妇,用于分离培养原始生殖细胞.人子宫内膜来源于因子宫肌瘤行子宫切除术的患者,用于制备成纤维细胞饲养层.清洁级10周龄雄性裸鼠2只,用于体内分化实验.方法:从人胚胎生殖嵴、肠系膜中消化分离的原始生殖细胞,将其接种在人子宫内膜成纤维细胞饲养层上传代培养.体内实验取连续传5代的2个细胞株,分别制备浓度为1×109 L-1的细胞悬液,于每只小鼠两侧腹股沟处皮下各接种0.5 mL,培养8周.体外分化采用无黏附特性的培养瓶和除去白血病抑制因子的原始牛殖细胞培养液,以脱饲养层法悬浮培养扩增的细胞,直到拟胚体形成及贴壁分化.主要观察指标:通过免疫荧光检测胚胎干细胞特异性表面标志物的表达、碱性磷酸酶染色及染色体核型分析,对所培养细胞进行鉴定.检测裸鼠体内畸胎瘤的形成及组织分化.免疫组化染色观察体外肌肉特异性肌动蛋白、巢蛋白、广谱细胞角蛋白的表达.结果:①传至第2、7代的人胚胎原始生殖细胞SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81等表面标志物均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色呈阳性,染色体分析为正常二倍体核型46XX.②接种8周末,2只小鼠均形成皮下畸胎瘤,其内存在囊括3个胚层的组织结构,包括皮脂腺、脂肪、腺体及腺上皮、鳞状上皮等.③培养第4天形成拟胚体,肌肉特异性肌动蛋白、巢蛋白、广谱细胞角蛋白均呈阳性表达.结论:人子宫内膜成纤维细胞可以作为人原始生殖细胞的饲养层细胞,传代后的原始生殖细胞仍保持胚胎干细胞的未分化状态和发育全能性.

Biological characteristics of human primordial germ cells on endometrial feeder layer