骨肉瘤源外泌体通过Tim-3诱导巨噬细胞M2极化并促进MG63细胞的 转移

目的：探究骨肉瘤来源的外泌体对肿瘤相关巨噬细胞分化的影响及其具体作用机制。方法：收集2018年3月至 2019年10年于川北医学院附属医院骨科及小儿外科行骨肉瘤切除术、病理诊断明确的18例原发性骨肉瘤患者的肿瘤组织及癌 旁组织，Western blotting实验检测Tim-3的表达水平；分离骨肉瘤MG63细胞外泌体（MG63-Exo），并采用透射电镜及纳米粒径分 析进行鉴定，双荧光染色法验证其是否能够被巨噬细胞吞噬，利用qPCR检测MG63-Exo对巨噬细胞分化及IL-10、TGF-β、VEGF 表达的影响，应用Transwell侵袭和迁移实验及Western blotting检测MG63-Exo所诱导分化的巨噬细胞对MG63细胞迁移及侵袭 及EMT相关蛋白表达的影响；应用CRISPR/Cas9技术敲除MG63细胞中的Tim-3，Western blotting实验检测MG63-Exo中Tim-3 表达，再次应用qPCR、Transwell及Western blotting实验检测来源于敲除Tim-3的MG63外泌体对巨噬细胞分化及其处理后的巨 噬细胞对MG63的迁移、侵袭、EMT相关蛋白表达的影响；最后利用骨肉瘤肺转移小鼠模型验证上述不同来源的外泌体对骨肉瘤 肺转移的影响。结果：透射电镜及纳米粒径分析结果证实成功分离了MG63-Exo，荧光共聚焦显微观察结果显示其能够被巨噬 细胞吞噬。与对照组相比，MG63-Exo能够显著促进巨噬细胞的M2型分化（P<0.05）；与对照组相比， 经MG63-Exo诱导的M2巨 噬细胞能够显著促进骨肉瘤细胞的迁移、侵袭与EMT能力（均P<0.05）；应用CRISPR/Cas9技术敲除Tim-3后的MG63细胞中 Tim-3 mRNA及蛋白表达均显著降低（P<0.05）， 且Tim-3能够以外泌体的形式转移至巨噬细胞中； 与MG63-Exo共培养的巨噬细 胞相比，来源于Tim-3敲除细胞的MG63-Exo能显著抑制巨噬细胞的M2型分化（P<0.05）；相比与经MG63-Exo诱导的巨噬细胞 进行共培养的MG63细胞，Tim-3敲除的MG63-Exo诱导的巨噬细胞能显著抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭与EMT及促进肿瘤肺转移 （均P<0.05）。结论：骨肉瘤来源的外泌体通过Tim-3诱导巨噬细胞的M2极化并促进肿瘤的侵袭及转移能力。

Osteosarcoma-derived exosomes induces M2 polarization of macrophages and promotes metastasis of MG63 cells through Tim-3