| D-氨基酸氧化酶在毕赤酵母中的表达及快速纯化 |
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| 引用本文： | 冯美卿,史训龙,孙传文,周伟,周珮. D-氨基酸氧化酶在毕赤酵母中的表达及快速纯化[J]. 复旦学报(医学版), 2006, 33(5): 622-625 |
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| 作者姓名： | 冯美卿 史训龙 孙传文 周伟 周珮 |
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| 作者单位： | 复旦大学药学院生物合成药物化学教研室,上海,200032;复旦大学药学院生物合成药物化学教研室,上海,200032;复旦大学药学院生物合成药物化学教研室,上海,200032;复旦大学药学院生物合成药物化学教研室,上海,200032;复旦大学药学院生物合成药物化学教研室,上海,200032 |
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| 摘 要： | 目的建立简便、快速纯化D-氨基酸氧化酶（DAAO）的新方法，以利用高纯度的DAAO转化头孢菌素C制备戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸（GL-7ACA）。方法通过基因工程手段，构建N端和C端各镶嵌6个组氨酸的DAAO重组质粒，电转化Pichia pastoris GS115电感受态细胞，利用PCR方法筛选阳性转化子，再经甲醇诱导筛选出高表达菌。结果高表达重组菌（PHD12）摇瓶发酵单位达到2000IU／L，发酵罐内达到22500IU／L。并利用Ni螯合型树脂对表达的DAAO经一步分离纯化，以60％的总收率获得纯化产物。纯化产物保持良好的转化CPC-Na活性。结论利用基因工程表达组氨酸标记蛋白，可简化基因工程的下游工序。
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| 关 键 词： | D-氨基酸氧化酶 毕赤酵母 表达 快速纯化 |
| 收稿时间： | 2006-01-18 |
| 修稿时间： | 2006-01-18 |
Expression and quick purification of recombinant D-amino acid oxidase in Pichia pastoris |
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| FENG Mei-qing,SHI Xun-long,SUN Chuan-wen,ZHOU Wei,ZHOU Pei. Expression and quick purification of recombinant D-amino acid oxidase in Pichia pastoris[J]. Fudan University Journal of Medical Sciences, 2006, 33(5): 622-625 |
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| Authors: | FENG Mei-qing SHI Xun-long SUN Chuan-wen ZHOU Wei ZHOU Pei |
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| Abstract: | Purpose To develop a new method to purify D-amino acid oxidase(DAAO) efficiently and fast. Methods Six additional histidine amino acid residues were tagged at N and C-termini of DAAO.His-tagged DAAO gene was cloned into pPIC3.5k of Pichia pastoris.Then it was purified by nickel-chelate chromatography. Results His-tagged protein was successfully expressed in Pichia pastoris GS115 with 22 500 IU per liter and purified quickly to total yield of 60% by one step. Conclusions His-tagged enzyme still keeps the capability of bioconversion cephalosporin C to 7-glutary cephalosporanic.The purification was more fast and efficiently. |
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| Keywords: | D-amino acid oxidase Pichia pastoris expression purification |
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