| 摘 要： | 目的:通过构建血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)的内皮生长因子样结构域(D2)、富含丝氨酸/苏氨酸结构域(D3)及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的大肠埃希菌表达体系,以获得TM-D23-GFP融合蛋白。方法:从美国国家生物技术信息中心查询TM的D23结构域、GFP的氨基酸序列,进行密码子优化和全基因合成,利用双酶切法将目标基因插入表达载体PET30a中,转化DE3菌株、诱导表达,通过镍离子-亚胺二乙酸-琼脂糖凝胶树脂(Ni-iminodicitic acid-sefinose resin,Ni-IDA)亲和层析、Q Sepharose TM FF离子交换层析纯化,最终得到TM-D23-GFP融合蛋白。结果:经酶切和测序鉴定证实,TM-D23片段已正确插入PET30a表达载体中;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)检测结果证实,含His-tag标签的TM-D23-GFP融合蛋白成功表达,且其相对分子质量约为60 000。结论:构建的TMD23-GFP融合蛋白可在DE3表达菌株中进行表达,为后期融合蛋白的功能研究打下基础。
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