人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的：构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法：实验于2005-03／2005—10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3．1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点，将其分别定向连人真核双表达载体pIPES，构建同时表达两个目的基因的双顺反子，通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞，通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果：①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定：将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoⅠ／MluⅠ和Xba Ⅰ／NotⅠ双酶切，经10g／L琼脂糖凝胶电泳可见1．2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带，酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实，目的基因插入片段方向正确，DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达：以转染pIPES空质粒为阴性对照，48h后提取转染细胞的RNA分别用P1，P2和P3，P4作为引物进行反转录一聚合酶链反应。结果表明转染pIPES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1．2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165 mRNA。结论：成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒，为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。

Construction and in vitro expression of bicistronic eukaryotic expression plasmid containing human bone morphogenetic protein-2 and vascular endothelial growth factor 165 genes