ED-L2-LMPl-EGFP融合基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鏊定EB病毒LMPl基因和增强型绿色荧光蛋白基因融合慢病毒表达载体.方法 应用DNA重组技术,将EB病毒ED-L2启动子和LMP1基因克隆到带有EGFP基因的FUGW慢病毒表达载体上,筛选阳性克隆,经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组载体后,以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV△8.9、包膜基因VSVG和带目的 基因ED-L2-LMP1-EGFP载体共同转染到293FT包装细胞内包装病毒,荧光显微镜下观察包装细胞报告基因表达情况,收集病毒上清、浓缩鉴定、测定重组病毒的滴度.PCR和免疫组化鉴定LMP1表达.结果 融合慢病毒表达载体质粒限制性酶切分析证实有782 bp的ED-L2和1 300 bp的LMP1基因片段基因片段插入到慢病毒栽体中.转染重组ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒融合载体的细胞于荧光显微镜下呈绿色荧光;对该细胞PCR可以扩增出404 bp大小的LMP1基因片段和370 bp的EGFP基因片断;免疫组化证明LMP1蛋白在转染细胞表达阳性.结论 成功构建了ED-L2-LMP1-EGFP基因的慢病毒表达载体,为进一步在体研究LMP1基因的功能奠定了基础.