人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定

背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用.本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a( )中.进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性.结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a( )载体中,经酶切与测序鉴定完全正确.此重组质粒转化人大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr 70 000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%.经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%.结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达:蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡.

Cloning and expression of recombinant mitochondrial Delta1-120 apoptosis-inducing factor and its enhancive effect on apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721