P19胚胎癌细胞体外定向心肌细胞分化模型的构建*★○

目的：如何在体外将胚胎干细胞培育转化为大量的心肌细胞并进行移植，使之成为具有成熟心肌细胞功能？实验采用不同诱导剂对P19胚胎干细胞进行诱导，拟构建体外定向心肌细胞分化模型。方法：实验于2006-09/2007-03在日本东京工业大学生体分子机能工学研究室完成。①材料：P19细胞由日本东北大学加龄医学研究所提供。钙粘素融合蛋白N-cad-Fc由本研究室合成。②实验方法：P19细胞按1×107 L-1密度接种进行悬浮培养，分别以终浓度1，5，10，50，100 nmol/L视黄酸及0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%二甲基亚砜各自诱导4 d，将形成的细胞聚集体分别接种于预铺有0.1%明胶、2.5mg/L N-cad-Fc、10 mg/L N-cad-Fc基质的24孔板中培养10 d。③实验评估：观察不同诱导条件及不同基质上的细胞跳动情况，免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白Troponin T的表达，RT-PCR法检测心肌细胞标志性基因cardiac actin、gata-4的表达。结果：①P19细胞经1，5，10 nmol/L视黄酸或0.5%、0.75%、1%二甲基亚砜诱导后，均出现可自主节律跳动的细胞。P19细胞聚集体悬浮培养至20d，预铺有0.1%明胶、2.5 mg/L N-cad-Fc及10 mg/L N-cad-Fc基质的培养板上节律跳动细胞团的出现率分别为44.6%、71.3%和70.1%。②药物诱导后，P19细胞心肌特异性蛋白Troponin T呈阳性表达。③与传统预铺有明胶的培养板比较，在预铺有N-cad-Fc的培养板上心肌标志性基因cardiac actin、gata-4的表达均明显升高，但10 mg/L N-cad-Fc的表达量略低于2.5 mg/L N-cad-Fc。④分别在上述不同基质上单层培养的P19细胞，二甲基亚砜诱导14 d后均仍呈上皮样细胞形态，未见跳动细胞出现，RT-PCR检测无心肌标志性基因表达。结论：①使用0.5%~1%二甲基亚砜或1~10 nmol/L视黄酸可成功诱导P19细胞心肌分化，心肌特异性蛋白Troponin T 的表达早于心肌跳动的出现。②作为一种基质模型来模拟细胞间黏附，2.5 mg/L N-cad-Fc是较适宜P19细胞心肌分化的条件。③P19细胞心肌分化有赖于药物诱导和细胞成团的共同作用，细胞间黏附分子对其分化有促进作用。

Establishment of a model of P19 embryonal carcinoma cells differentiation into cardiomyocytes in vitro