群体感应调控子AphA对河弧菌Ⅵ型分泌系统VflT6SS2的调控研究

目的 研究河弧菌群体感应调控子AphA对Ⅵ型分泌系统VflT6SS2功能活性的调控机制。方法 采用Western Blot检测河弧菌野生株、aphA缺失株（ΔaphA）和aphA回补株中VflT6SS2标志性组件溶血素共调节蛋白（Hcp）的表达和分泌。采用实时荧光定量PCR和启动子-lux 融合冷光系统检测野生株和ΔaphA中VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇代表基因tssB2、hcp（tssD2）和vgrG（tssI2）以及群体感应调控子HapR的mRNA相对表达量和启动子活性。采用定点突变实验结合启动子活性测定确定AphA在 tssD2b启动子区的调控结合位点；采用电泳迁移率位移测定（EMSA）确定AphA与hapR启动子的结合。结果 ΔaphA中tssB2、hcp（tssD2）、vgrG（tssI2）和hapR的mRNA相对表达量及Hcp蛋白的表达分泌明显高于野生株。VflT6SS2核心基因簇、tssD2a、tssI2a和hapR的启动子活性在ΔaphA中均高于野生株，而tssD2b启动子活性则低于野生株。tssD2a和tssD2b的启动子序列分析显示-335 bp~-229 bp区差异较大，在tssD2b中该区域存在2个潜在AphA结合位点，将其中的保守位点ATG替换为CGA，tssD2b启动子活性明显降低。EMSA结果显示，AphA与hapR启动子直接结合。结论 AphA在转录水平直接抑制hapR的表达，间接参与对VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇的调控。AphA对tssD2a和tssD2b呈现相反的调控模式，AphA可直接与tssD2b启动子区（-335 bp~-229 bp）结合正向调控tssD2b的表达。