胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1联合诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化特点

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1体外联合诱导对脊髓源性神经干细胞分化的影响,为了解神经干细胞在体内多因素环境下的分化表现提供实验依据。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。①碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白多抗,神经丝蛋白单抗(Sigma)。②选用清洁级孕16d的SD大鼠10只,无菌条件下取出胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。基础培养基组成:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02B27添加液的DMEM/F12。③原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆,在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清作为对照。同时设立碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组,换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化行为,免疫细胞化学染色标记神经元与星状胶质细胞的表达。④通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化的形态学观察:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出3种神经细胞类型:神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②神经干细胞免疫组织化学检测:血清对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组、胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③流式细胞荧光分选计数:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元分化比例最高,明显高于碱性成纤维细胞生长因子组(χ2=19.56,P<0.05),而与血清对照组、转化生长因子β1组比较差异有极其显著性意义(χ2=24.15,25.32,P均<0.01)。碱性成纤维细胞生长因子组星状胶质细胞分化比例最低,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组组与其相近(χ2=17.23,P>0.05),而血清对照组、转化生长因子β1组则显著升高(χ2=24.45,23.79,P均<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,为脊髓原位神经干细胞分化及神经干细胞移植体内后的分化表现提供了实验数据。

Differentiation traits of rat spinal cord derived neural stem cells following combined inducement of glial cell line-derived neurotrophic factor and transforming growth factor beta 1