人脐血间充质干细胞体外分离培养条件的优化及其鉴定

背景：相对于骨髓间充质干细胞来说，脐血间充质干细胞是一种较为理想的新的组织工程种子细胞来源，但其培养成功率较低。 目的：通过对培养基的选择、离心速度及时间、接种密度、生长因子的选择、首次换液时间等条件进行优化，拟建立一种稳定可靠的人脐血间充质干细胞的体外分离培养方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-01/10在白求恩国际和平医院输血科完成。 材料：健康足月剖宫产新生儿脐带血20份，由白求恩国际和平医院干细胞中心提供，产妇及其家属均知情同意。 方法：无菌条件下采集脐血，采用密度梯度离心法(1 500 r/ min 离心15 min)结合直接贴壁法体外分离脐血间充质干细胞，加入含体积分数为10%人脐带血血清、5 μg/L GM-CSF、15 μg/L白细胞介素3的DMEM/F12培养基，调整细胞密度为1×1010 L-1接种于人脐带血血清包被过的塑料培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度环境下培养，3 d后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每隔24 h换液1次。当培养瓶中的细胞生长到80%融合时，胰酶-EDTA混合液消化传 代。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞免疫表型。 结果：24 h后可见有少量细胞贴壁，48 h后贴壁细胞增多，并出现少量单极梭形细胞，7 d后可见细胞形成集落，培养两三周形成平行排列、辐射状或漩涡状细胞界限不清楚的成纤维样细胞，且80%~90%呈现融合。第2代细胞接种后12 h开始贴壁，10 d即可达80%~90%融合。流式细胞仪分析显示，此类细胞稳定地表达相关抗原标记CD29及CD44，但不表达造血细胞系表面标记CD34。 结论：实验在体外改良培养条件下成功分离出人脐血间充质干细胞，培养周期较短，细胞纯度较高，贴壁细胞稳定表达间充质干细胞表面相关抗原。

Optimization and identification of in vitro isolation and culture condition of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells