VEGF对兔骨髓基质干细胞成骨诱导及成骨细胞分化与增殖影响的体外研究

目的探讨体外条件下成骨诱导剂和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的联合应用对兔骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)成骨分化过程中细胞增殖和分化的影响,为骨组织工程研究提供实验基础。方法取2月龄新西兰大耳白兔,麻醉后抽取股骨骨髓进行BMSCs原代细胞培养,取生长良好的第三代BMSCs进行分组培养。空白组:完全培养基培养;对照组:完全培养基中加入成骨诱导剂;实验组:完全培养基中加入成骨诱导剂及VEGF(10ng/ml)。MTT法检测诱导BMSCs成骨分化过程中细胞生长与增殖情况并绘制生长曲线;倒置相差显微镜、光学显微镜及扫描电镜观察诱导BMSCs成骨分化过程细胞的形态特征;茜素红(Alizarin Red S,ARS)染色鉴定钙结节;碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、ALP活性及RT-PCR检测I型胶原(Collagen typeⅠ,colⅠ)mRNA表达;免疫组化染色检测诱导后细胞中VEGF蛋白表达情况。结果 1诱导BMSCs向成骨细胞分化后细胞呈圆形或多边型,短柱状或立方形,细胞表面有短的突起与相邻细胞连接。2茜素红染色光学显微镜下可见实验组和对照组均有散在的红色团块即钙结节。3二组中ALP染色均可见细胞浆内有黑色的碱性磷酸酶颗粒,但实验组ALP染色阳性细胞数多于对照组(P<0.05)。4诱导培养的成骨细胞ALP活性测定实验组和对照组ALP活性早期较低,以后逐渐增高,第四天起,实验组明显高于对照组(P<0.05)。5MTT法检测细胞增殖状态,实验组细胞增殖速度高于对照组,6~8d细胞增殖速度加快,二组比较差异有统计学意义(P<0.05)。6RT-PCR检测成骨细胞colⅠmRNA表达,诱导后实验组和对照组均可见colⅠmRNA表达,实验组colⅠmRNA的表达强度高于对照组。7免疫组化染色显示BMSCs的VEGF蛋白呈阴性表达,而诱导分化后的成骨细胞实验组与对照组均可见有VEGF蛋白表达且实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 1BMSCs在成骨诱导剂作用下可向成骨细胞诱导,成为骨组织工程中理想的种子细胞。2 VEGF可促进成骨细胞的增殖和分化,当与成骨细胞诱导剂联合应用时,能够提高成骨细胞的增殖能力、增强成骨细胞的ALP活性,二者的协同作用共同促进了BMSCs向成骨细胞的增殖和分化,将有望提高骨缺损修复的治疗效果。