微量酶标夹心杂交法定量检测人iNOS—mRNA

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术，对人iNOS—mRNA进行定量检测。方法：设计两条特异探针，其中一条为用捕获探针，5’端连接氮基，能与微孔板表面的NOS基团共价结合，“竖直”地包被在微孔中，另一个为检测探针，3’端带有生物素标记。用脂多糖(LPS)刺激人外周血单个核细胞24h后，提取巨噬细胞总RNA，进行RT—PCR扩增，PCR产物热变性后加入到已包被捕获探针的微孔板内，并加入检测探针进行夹心杂交，最后加入链亲和素一辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物，在450nm波长检测杂交信号。结果：该方法检测iNOS—mRNA的灵敏度明显高于RT—PCR一琼脂糖凝胶电泳；特异性高，RT—PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现；重复性良好。结论：本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化，适合于iNOS—mRNA的定量检测。