靶向hTERT基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建hTERT 基因RNAi 慢病毒载体,为大肠癌RNAi 介导的基因治疗打下基础.方法 化学合成3 条靶向hTERT 基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,48 h 后采用RT-PCR 方法筛选出一条对hTERT mRNA 有明显抑制作用的siRNA.针对已经筛选确定的hTERT 基因RNAi 有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ酶切后的GP-Supersilencing Vector 载体[含U6 启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shhTERT 慢病毒载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shhTERT、pGag/Pol、pRev 和pVSV-G 4 质粒共转染包装细胞293T 细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP 蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR 和测序证实,成功构建hTERT shRNA 的慢病毒载体LV-shhTERT.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1 ×108 UT/ml.结论 成功构建了hTERT 基因RNAi 慢病毒载体.