^99Tc^m-亚锡葡庚糖酸钠结合GGC序列监测基因治疗的实验研究

目的 构建以金属结合肽（双甘氨酰半胱氨酸,即GGC序列）为核素报告基因、人VEGF165为治疗基因的重组腺病毒载体,以99Tcm-GH为报告探针,探讨该报告系统监测治疗基因表达的可行性.方法 pcDNA3-VEGF165质粒线性化后,将金属结合肽GGC序列连于VEGF165基因C端,通过内部核糖体切入位点（IRES）连接增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,构建重组腺病毒载体Ad5-VEGF165GGCmotif-IRES-EGFP（Ad5-VIE）,同时构建腺病毒包装EGFP（Ad5-EGFP）为对照.以不同感染复数（MOI=0,10,25,50,100）Ad5-VIE感染大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）后,用99Tcm-GH为报告探针,研究感染细胞摄取动力学（30,60,90和120 min）情况,以检测GGC序列在MSC中的表达,并与实时定量PCR、Western-blot蛋白印迹、免疫组织化学等方法鉴定的VEGF165表达进行对比分析.通过荧光显微镜及实时定量PCR检测EGFP在细胞中的表达.采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,组间比较运用独立样本成组t检验、q检验和直线（Pearson）相关分析.结果 以Ad5-VIE感染MSC后,不同MOI摄取实验结果示细胞对99Tcm-GH的摄取率随病毒MOI的增加而逐渐增加（r2=0.86,P＜0.05）,并且在MOI=100时达到（7.94±0.75）%;不同时间摄取实验示随99Tcm-GH孵育时间延长,细胞摄取率逐步增高,至120 min时达到（7.72±0.22）%.Ad5-VIE感染组与Ad5-EGFP感染组摄取率在各个不同时间点差异均有统计学意义（t=15.10～54.92,P均＜0.05）.在mRNA水平上,VEGF165及EGFP表达均随病毒MOI增加而增加（r2=0.99,P＜0.05）.不同MOI下细胞对99Tcm-GH的摄取与VEGF165蛋白表达呈较好的相关性（r2=0.90,P＜0.05）.免疫组织化学检查结果表明人VEGF165目的 基因在MSC中成功表达.荧光显微镜下可以观测到被感染细胞中的EGFP蛋白.结论 成功构建的重组腺病毒系统Ad5-VIE感染MSC对99Tcm-GH的摄取与VEGF165表达呈正相关.以GGC多肽为报告基因可以监测治疗基因VEGF165的表达,为核素报告基因显像提供了理论依据.

The experimental study of monitoring gene-based therapy with the binding of diglycylcysteine binding motifs and 99Tcm-glucoheptonate