| 摘 要： | 目的观察慢病毒介导的RNA干扰c-Met基因后肝细胞生长因子(HGF)对结肠癌细胞株SW480侵袭能力的影响。方法实验分为3组,正常对照组(NC组):正常目的细胞加sh RNA阴性对照病毒感染细胞(NC组又分为NC-20和NC-40 2个亚组,分别代表正常目的细胞感染sh RNA阴性对照病毒后在Transwell外室中分别加入浓度为20和40 ng/m L的HGF);c-Met基因敲除组(KD组):正常目的细胞加RNA干扰靶点病毒感染细胞(KD组又分为KD-20和KD-40 2个亚组,分别代表正常目的细胞感染目的基因sh RNA-c-Met病毒后在Transwell外室中分别加入浓度为20和40 ng/m L的HGF;KD1、KD2、KD3和KD4组分别表示针对目的基因不同的RNA干扰靶点,以挑选其中最有效的干扰靶点);空白对照组(CON组):正常目的细胞加未感染任何病毒的细胞。构建sh RNA-c-Met慢病毒表达载体,实时定量PCR(RT-PCR)筛选阳性克隆并测序鉴定;经慢病毒质粒包装后转染SW480细胞,转染48 h后,RT-PCR法检测SW480细胞中c-Met m RNA表达,Western blot法检测SW480细胞中c-Met蛋白表达水平;转染72 h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。结果 sh RNA-c-Met慢病毒表达载体构建成功;sh RNA-c-Met显著下调了SW480细胞中c-Met m RNA的表达,并且RNA干扰靶点病毒感染细胞第4靶点时的基因敲减效率最高(81.4%),为最有效靶点。Western blot检测结果显示,KD组SW480细胞中c-Met蛋白表达明显低于NC组(P=0.015)和CON组(P=0.010),KD组SW480细胞凋亡率明显高于NC组(P0.001)和CON组(P0.001)。细胞转移率在KD组、KD-20组和KD-40组均分别明显低于NC组(P0.001)、NC-20组(P=0.015)及NC-40组(P=0.017);与NC组比较,NC-20组和NC-40组的细胞转移率明显升高(P0.001、P0.001),且NC-40组的细胞转移率明显高于NC-20组(P=0.005);同样,与KD组比较,KD-20组和KD-40组的细胞转移率均明显升高(P0.001、P0.001),KD-40组的细胞转移率明显高于KD-20组(P=0.014)。结论以c-Met为靶点的RNA干扰能明显下调结肠癌细胞株SW480中c-Met的表达,c-Met的表达下调能明显增加细胞凋亡且能降低HGF对SW480细胞侵袭能力的影响。
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