参环毛蚓体内核苷磷酸化酶的活性测定及动力学分析

目的 建立参环毛蚓体内嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的检测方法，以肌苷为底物，评价该酶的活性。方法 采用HPLC法，色谱条件：Ecosil C18-AQ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为10 mmol·L-1磷酸二氢铵缓冲液（pH4.5）和甲醇，梯度洗脱，流速为0.8 mL·min-1，柱温为室温，检测波长254 nm，用底物肌苷与组织粗蛋白提取液在室温孵育30 min，沸水煮5 min终止反应，12000 r·min-1离心10 min，取上清过滤后进行HPLC分析，以OriginPro 8.5软件作图，计算酶动力学参数。结果 酶反应中产物次黄嘌呤在0.5～40 μmol·L-1范围内呈良好的线性关系（r=0.9996）；精密度小于3.5 %，回收率大于80 %。PNP酶动力学参数：Vmax为0.015 nmol·min-1·mg-1，Km为19.8 μmol·L-1。结论 成功构建了参环毛蚓体内次黄嘌呤代谢酶活性测定相关的实验体系，该法所得数据稳定可靠，可准确反映关键酶活性的动态变化。