维生素D受体FokⅠ多态性对牙周组织细胞CYP24A1表达的影响

目的：维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）基因的第二外显子存在唯一一个可以影响VDR蛋白结构的多态性位点，其可以由限制性核酸内切酶FokⅠ所识别，分为FF、Ff和ff三型。CYP24A1是维生素D 24羟化酶的编码基因，是常见的维生素D效应基因。本研究将探讨人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，hGF）和牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLC）中VDR FokⅠ多态性对CYP24A1表达的影响。方法：原代培养12名供体的hGF和hPDLC，提取基因组DNA，PCR扩增包含多态性位点的267 bp的片段。根据FokⅠ对片段酶切的结果判断VDR-FokⅠ基因型。确定基因型后，给各基因型hGF和hPDLC以10 nmol/L 1α,25双羟维生素D3（1,25OH2D3）或1 000 nmol/L 25羟维生素D3（25OHD3）刺激48 h，提取RNA，其中10 nmol/L 1,25OH2D3刺激48 h后还提取蛋白。之后给予hGF和hPDLC VDR拮抗剂ZK159222，再以10 nmol/L 1,25OH2D3或1 000 nmol/L 25OHD3刺激48 h，提取RNA。应用Real-time PCR和Western blot的方法检测维生素D24羟化酶CYP24A1和VDR的mRNA和蛋白的表达水平。结果：12名供体中，FF、ff和Ff型分别为4例、3例和5例。1,25OH2D3刺激hGF和hPDLC后，FF型细胞CYP24A1的mRNA表达水平显著高于Ff型或ff型细胞（hGF：F=31.147，P＜0.01；hPDLC：F=23.347，P＜0.01）；FF型细胞CYP24A1的蛋白表达水平同样显著高于Ff型或ff型细胞（hGF：F=12.368，P＜0.01；hPDLC：F=15.749，P＜0.01）。25OHD3刺激hGF和hPDLC后，FF型细胞CYP24A1的mRNA表达水平也显著高于Ff型或ff型细胞（hGF：F=32.061，P＜0.01；hPDLC：F=32.569，P＜0.01）。如1,25OH2D3刺激伴有ZK159222，则三型细胞CYP24A1的mRNA表达水平差异无统计学意义（hGF：F=0.246，P=0.787；hPDLC：F=0.574，P=0.583）。如25OHD3刺激伴有ZK159222，则三型细胞CYP24A1的mRNA表达水平差异也无统计学意义（hGF：F=1.636，P=0.248；hPDLC：F=0.582，P=0.578）。不同刺激条件下，hGF和hPDLC两种细胞比较CYP24A1或VDR的表达水平，差异均无统计学意义。结论：在hGF和hPDLC中，FF型VDR可介导比其他基因型VDR更为显著的CYP24A1上调，提示FF型VDR可能具有更强的转录活性。