| TRAIL胞外段基因克隆及其表达与纯化 |
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| 引用本文： | 周海胜,田方,肖凤君,张立新,李克勤. TRAIL胞外段基因克隆及其表达与纯化[J]. 中国免疫学杂志, 2002, 18(7): 451-453 |
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| 作者姓名： | 周海胜 田方 肖凤君 张立新 李克勤 |
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| 作者单位： | 军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物室,北京,100039 |
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| 摘 要： | 目的克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因(the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex),构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段.方法抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞,用RT-PCR、巢式-PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA,并克隆到pGEM-T Easy载体中,DNA测序鉴定.将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T,构建重组表达质粒pGEX/TRAILex,用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段,GST-Agarose 4B层析柱纯化GST-TRAILex融合蛋白,Westem-blot鉴定纯化产物.结果抗CD3 McAb能诱导正常人外周血单个核细胞TRAIL的高表达,成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因,构建了重组表达载体pGEX/TRAILex,IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段,经12%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量和理论值相符(约54kD)的诱导表达带.Kodak软件分析表面GST-TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28%,进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达,用GST-Agarose4B层析柱纯化超声破菌后的上清,每升细菌培养液可得到9.8 mg纯度的95%以上的GST-Tex.Western-blot结果证实54KD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应.结论成功地克隆了人TRAIL基因,并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段,为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.
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| 关 键 词： | TNF相关的凋亡诱导配体 基因克隆 基因表达 蛋白质纯化 |
| 文章编号： | 1000-484X(2002)07-0451-04 |
| 修稿时间： | 2001-04-27 |
The gene clone and expression of extracellular region of the TRAIL |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | TRAIL Extracellular region of TRAIL Gene done Gene expression |
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