不同时间点应用甲氨蝶呤对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的探讨不同时间点应用低剂量甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后神经细胞凋亡的作用,探讨其潜在的神经保护机制与合适的给药时机。方法取成年雄性SD大鼠120只,体质量247~286 g,随机分为4组(n=30),分别为假手术组(A组)、对照组(B组)、MTX治疗组(C组)和MTX预防组(D组)。A组仅行椎板切除,B、C、D组采用改良Allen法制备SCI模型;C组于术后1、6、12、18、24 h,D组于术前30 min及术后6、12、18、24 h,经尾静脉注射MTX(0.5 mg/kg);A、B组于术后1、6、12、18、24 h注射等量生理盐水。术后观察大鼠一般情况,于1、3、7、14、21 d采用BBB评分进行神经功能评估;取材行组织学观察脊髓形态学变化,免疫组织化学染色观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达,TUNEL标记观察细胞凋亡水平。结果 B、C、D组实验过程中共死亡10只大鼠,最终各组纳入25只大鼠进行观察。各时间点A组BBB评分均高于B、C、D组(P0.05),从3 d开始C、D组评分明显高于B组(P0.05);D组从3 d开始均高于C组,除21 d(P0.05)外,其余各时间点比较差异均有统计学意义(P0.05)。组织学观察示,A组术后各时间点脊髓组织为正常结构;D组SCI程度轻于B、C组,C组轻于B组;从14 d开始,B、C、D组病变范围基本固定。各时间点B、C、D组Caspase-3及TUNEL阳性细胞数均显著多于A组,B组多于C、D组,比较差异有统计学意义(P0.05);C组Caspase-3阳性细胞数均多于D组,其中3、7、14 d比较差异有统计学意义(P0.05),而TUNEL阳性细胞数仅3、7 d显著多于D组(P0.05)。术后1、3、7、14、21 d,B、C、D组组内Caspase-3、TUNEL阳性细胞数均成正相关(P0.05)。结论低剂量MTX能够通过抑制神经细胞凋亡有效阻止SCI的继发性损伤;预防性应用MTX效果优于单纯治疗性应用。