| 摘 要： | 目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(h Cu,Zn-SOD)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白,为其临床应用奠定基础。方法:根据已报道的h Cu,Zn-SOD基因序列,采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中获得SOD c DNA序列。将所得的PCR产物插入原核表达载体p ET22b(+)中,重组质粒经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将其转化至大肠杆菌Rosseta(DE3),通过异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)诱导表达出目的蛋白,经镍固定金属亲和层析纯化。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD生物学活性。结果:序列分析表明SOD基因成熟肽编码区含有465 bp与Gen Bank(X02317)中已报道序列一致的SOD核苷酸。经IPTG诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析显示表达的目的蛋白分子量约为19 k D,免疫印迹分析显示其与商品化的His-tag抗体呈特异性反应,但主要以包涵体形式表达,可溶性蛋白表达量很少。经Ni2+-NTA琼脂糖纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。可溶蛋白酶活力为460 U/ml(SOD的酶比活力为630 U/mg)。结论:在大肠杆菌中获得了人源SOD的高效表达,为研究其生物学功能及广泛应用奠定了基础。
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