银杏内酯K通过PI3K/Akt/mTOR通路促进血管生成改善缺血性卒中

目的探究银杏内酯K(Ginkgolide K,GK)通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对缺血性卒中小鼠血管内皮生长因子(VEGF)表达和脑血管生成的作用.方法将40只C57BL/6小鼠随机分为对照组、大脑中动脉闭塞(MCAO)组、低剂量GK(GK-L)组(3.5 mg/kg)、中剂量GK(GK-M)组(7 mg/kg)和高剂量(GK-H)组(14 mg/kg),每组各8只.建立MCAO模型和氧葡萄糖剥夺发(OGD)体外模型;采用改良后的神经系统严重程度评分(mNSS)评估法检测小鼠神经功能缺损;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色检测小鼠脑缺血面积;免疫荧光染色检测小鼠梗死灶周围皮质血管生成和星形胶质细胞覆盖.培养hCMEC/D3细胞,分为对照组,OGD组、OGD+CK组、OGD+LY组(LY为PI3K信号通路抑制剂)和OGD+GK+LY组,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测内皮细胞活性;Western blot检测内皮细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、VEGF和PI3K/Akt/mTOR通路相关基因蛋白表达;细胞划痕实验检测内皮细胞迁移能力;血管形成实验检测内皮细胞管腔形成能力.结果与MCAO组(5.37±1.25)分、(11.99±1.72)%]比较,GK-M组和GK-H组小鼠mNSS评分分别为(3.37±1.32)、(2.23±0.38)分]和脑缺血面积(4.75±0.89)%、(2.42±0.42)%]均显著降低(P<0.05).与MCAO组EdU+/CD31+细胞数、EdU+/GFAP+细胞数和星形胶质细胞覆盖率分别为(3.33±0.58)个、(4.33±1.53)个、(69.20±5.60)%]比较,GK组小鼠EdU+/CD31+细胞数(13.67±2.08)个,t=3.576]、EdU+/GFAP+细胞数(8.33±1.53)个,t=6.008]和星形胶质细胞覆盖率(82.26±7.77)%]显著升高(均P<0.05).与对照组细胞活力、HIF-1α、VEGF蛋白表达、Akt和mTOR磷酸化水平分别为(100.31±3.01)%、(0.09±0.03)、(0.13±0.03)、(0.20±0.04)、(0.18±0.03)]比较,OGD组细胞活力(52.37±9.06)%]、HIF-1α(0.17±0.02)和VEGF蛋白表达(0.18±0.03)、Akt和mTOR磷酸化水平(0.28±0.06),(0.38±0.05)]均显著升高(均P<0.05);与OGD组比较,OGD+GK组细胞HIF-1α(0.22±0.03)和VEGF蛋白表达(0.23±0.03)、Akt和mTOR磷酸化水平(0.48±0.09),(0.52±0.05)]、细胞活力(61.07±3.48)%]、迁移率(85.26±11.03)%]和管状结构数量(81.97±5.79)%]均显著升高(均P<0.05),OGD+LY组则表现出相反变化;PI3K信号通路抑制剂LY294002可逆转GK对OGD细胞的影响.结论GK通过PI3K/Akt/mTOR信号通路上调VEGF表达促进脑血管生成,改善小鼠缺血性卒中.

Ginkgolide K promotes angiogenesis and improves ischemic stroke through PI3K/Akt/mTOR pathway