吡喃糖氧化酶的原核表达及初步实验应用

目的原核表达、纯化、鉴定吡喃糖氧化酶(PROD),为其临床应用奠定基础。方法利用生物信息软件,比较不同种属的PROD核苷酸同源序列,优化设计PROD基因序列,委托上海捷瑞生物工程有限公司构建原核表达质粒pET15b-PROD,将此质粒导入大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。其超声后的沉淀、上清液经镍离子柱亲和层析纯化、脱盐后进行活性测定,并配成应用液检测50例(30例糖尿病患者,20例健康对照)血液标本中的葡萄糖水平,分析其与葡萄糖氧化酶法(GOD法)和已糖激酶法(HK法)检测血糖诊断糖尿病的效能。结果重组质粒pET15b-PROD经测序PROD基因序列长度为1 869bp,表达623个氨基酸。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示该蛋白在相对分子质量68×103处有一条明显的条带,该条带在超声后沉淀中很弱,而在上清中较浓。上清液经纯化后的纯度大于90%,活性超过60kU/g,用其测定空腹血糖并用于糖尿病诊断的受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积(AUC)为0.995,用GOD法和HK法的AUC分别为0.994、0.992。根据约登指数确定最佳临界点,上述3种方法分别为7.11、7.16、7.06mmol/L。结论本研究生产的PROD以上清液中的表达为主,其纯度优、活性强、产量高,可用于血糖的检测。在本研究的基础之上可进一步优化条件使之应用于临床标本中1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-AG)的检测。