人CD3ζRNAi逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:利用RNAi表达载体法构建并筛选携带针对CD3ζ基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法:利用DNA重组技术,设计3条60 bp能转录产生靶向CD3ζ小发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,以pSUPER.retro.neo+gfp质粒作为空载体经限制性核酸内切酶酶切后与RNAi序列进行重组,构建CD3ζ-pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体,脂质体法转染包装细胞系PA317,建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果:重组载体经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明CD3ζ-pSUPER retroRNAi重组质粒构建成功;脂质体法将重组载体转染包装细胞系PA317,表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。结论:成功地构建了特异性沉默CD3ζ基因的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞系,为后续研究CD59与CD3ζ在T细胞内信号转导的相互作用提供理论和实验依据。